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एनेक्सिन वी-आईएफ 647 / पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

मात्रा: 50 टी
उपलब्धता स्थिति:
  • G1514-50T
  • Servicebio
  • सर्विसबियो

उत्पाद वर्णन

उत्पाद की जानकारी:

उत्पाद का नाम

बिल्ली। नहीं।

आयतन

एनेक्सिन वी-आईएफ 647 / पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

G1514-50T

50t

G1514-100T

100 टी

उत्पाद वर्णन:

एपोप्टोसिस एक सामान्य शारीरिक प्रक्रिया है जो भ्रूण विकास और ऊतक होमियोस्टेसिस के रखरखाव की प्रक्रिया में होती है। यह कई morphological परिवर्तनों के साथ है। उनमें से, सेल झिल्ली का नुकसान एपोप्टोसिस की शुरुआती विशेषताओं में से एक है। सामान्य कोशिकाओं में, फॉस्फोटिडाइलेरिन (पीएस) केवल सेल झिल्ली के फॉस्फोलिपिड बिलायर के भीतरी तरफ वितरित किया जाता है, लेकिन एपोप्टोसिस के शुरुआती चरण में, पीएस लिपिड झिल्ली के बाहरी पक्ष से बाहरी पक्ष तक बाहर निकल जाएगा, इसे उजागर करेगा सेल के बाहर। Annexin v (Annexin v) एक Ca2 +-निर्भर फॉस्फोलाइपिड-बाध्यकारी प्रोटीन है जो पीएस के लिए उच्च संबंध के साथ है और विशेष रूप से पीएस के संपर्क में कोशिकाओं को बांधता है। इसलिए, अनुलग्नक वी का उपयोग प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए संकेतकों में से एक के रूप में किया जाता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एक न्यूक्लिक एसिड डाई है। यह तीव्र कोशिका झिल्ली और प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है, लेकिन देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के सेल झिल्ली में प्रवेश कर सकता है और नाभिक दाग सकता है।

यह उत्पाद प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एक पहचान जांच के रूप में अनुलग्नक वी लेबल वाले आईएफ 647 फ्लोरोसेंट डाई अणु का उपयोग करता है। साथ ही, पीआई का उपयोग नेक्रोटिक और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। अनुलग्नक वी-आईएफ 647 और पीआई का संयुक्त उपयोग, लाइव कोशिकाएं नकारात्मक धुंधला दिखाती हैं (अनुलग्नक वी- / पीआई-), प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं एकल फ्लोरोसेंस पॉजिटिव (एनेक्सिन वी + पीआई-) दिखाती हैं, और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाएं दोहरी प्रतिदीप्ति सकारात्मक दिखाती हैं (Annexin V + / PI +)। यह किट प्रवाह साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप पहचान के लिए उपयुक्त है।

भंडारण और परिवहन

गीले बर्फ में परिवहन; अंधेरे में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, 12 महीने के लिए मान्य।

अवयव:

घटक संख्या

अवयव

G1514-50T

G1514-100T

G1514-1

अनुलग्नक वी-आईएफ 647

250 μl

2 × 250 μl

G1514-2

प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई)

250 μl

2 × 250 μl

G1514-3

1 × बाध्यकारी बफर

25 मिलीलीटर

2 × 25 मिलीलीटर

उत्पाद उपयोगकर्ता पुस्तिका

1 पीसी

ऑपरेशन कदम:

1. निलंबन कोशिकाएं: सेल निलंबन लें, और सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 500 ग्राम पर 5 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें;

अनुवर्ती कोशिकाएं: पहले सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्रित करें। ईडीटीए मुक्त ट्रिप्सिन (जी 4002 अनुशंसित) के साथ पाचन के बाद, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन करें, और 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें। ट्राप्सिन पाचन समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए, ताकि अत्यधिक पाचन से बचें और झूठी सकारात्मक कारण बन सकें।

2. पूर्व-ठंडा पीबीएस (जी 4202 अनुशंसित) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और प्रत्येक बार 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें;

3. धीरे-धीरे पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर में कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें और सेल एकाग्रता को 1 ~ 5 × 106 / मिलीलीटर समायोजित करें;

4. सेल निलंबन के 100 μl लें, 5 μl annexin v-if647 और 5 μl पीआई जोड़ें, धीरे-धीरे मिश्रण करें, और कमरे के तापमान पर 8-10 मिनट के लिए प्रकाश से रक्षा करें;

5. पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर के 400 μl जोड़ें, धीरे-धीरे हिलाएं, और 1 एच के भीतर प्रवाह साइटोमीटर या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के साथ पहचान करें।

परिणाम विश्लेषण

1. प्रवाह साइटोमेट्री

ए। उपयुक्त वोल्टेज का चयन करें और प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के दौरान हल्के मुआवजे को समायोजित करें। प्रायोगिक समूह को छोड़कर वोल्टेज और एकल-लेबल नियंत्रण को समायोजित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (बिना किसी मार्कर के) स्थापित करने की सिफारिश की जाती है (केवल अनुलग्नक वी-आईएफ 647 और एनेक्सिन वी-आईएफ 647 जोड़े गए हैं)। समायोजन और मुआवजे के लिए केवल पीआई जोड़ें);

बी। प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के लिए संदर्भ उदाहरण:

जुरकैट टी लिम्फोमा कोशिकाएं 6 एच के लिए 5 माइक्रोन कैम्पटोथेकिन के साथ प्रेरित थीं। उपरोक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया का संदर्भ लें और परिणामों का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें। परिणाम नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाए जाते हैं।

IF647 की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 656 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 670 एनएम है; पीआई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 535 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 615 एनएम है। दो फैलाव बिंदु आरेख प्रवाह साइटोमीटर के प्रासंगिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा खींचा जाता है, और IF647 Abscissa पर है और पीआई ordinate पर है। एक ठेठ प्रयोग में, जीवित कोशिकाओं में कोई फ्लोरोसेंस नहीं होता है, और बिखरे हुए बिंदु निचले बाएं के पहले चतुर्भुज में होते हैं। शुरुआती चरण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं में मजबूत गुलाबी फ्लोरोसेंस होता है, और बिखरे हुए बिंदु निचले दाएं के दूसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं। देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाएं गुलाबी और लाल डबल फ्लोरोसेंस पेश करती हैं, और बिखरे हुए बिंदु ऊपरी दाएं के तीसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं।

2. फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप निरीक्षण

ग्लास स्लाइड पर 6 μL अनुलग्नक वी-आईएफ 647 और पीआई डबल-दाग सेल निलंबन जोड़ें, इसे एक कवर ग्लास के साथ कवर करें, और दो रंगीन फ़िल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। एनेक्सिन वी-आईएफ 647 में एक गुलाबी फ्लोरोसेंस सिग्नल है और पीआई लाल फ्लोरोसेंस सिग्नल है।

टिप्पणियाँ:

1. पूरे प्रयोग के दौरान, ऑपरेशन सेल टूटने से बचने के लिए जितना संभव हो सके कोमल होना चाहिए और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करना चाहिए।

2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोना नहीं छोड़ा जा सकता है, और साथ ही, जितना संभव हो सके अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें।

3. कोशिकाओं को पचाने के लिए ट्राप्सिन का उपयोग करते समय, आपको कोशिकाओं को कृत्रिम क्षति से बचने और पाचन समय को नियंत्रित करने के लिए सावधान रहना चाहिए। यदि पाचन समय बहुत छोटा है, तो कोशिकाओं को गिरने के लिए उड़ाया जाना चाहिए, जो कोशिका झिल्ली को यांत्रिक क्षति का कारण बन सकता है; यदि पाचन समय बहुत लंबा है, तो सेल झिल्ली भी क्षति के लिए कमजोर है। परीक्षण परिणामों को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, ईडीटीए युक्त पैनक्रेटिन का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ईडीटीए अनुलग्नक वी और पीएस के बाध्यकारी को प्रभावित करेगा।

4. अनुपालन कोशिकाओं को एपोप्टोसिस द्वारा उत्तेजित करने के बाद, यदि कुछ कोशिकाएं तैरती हैं, तो सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और अनुवर्ती कोशिकाओं को इकट्ठा करना और एक ही समय में उन्हें दागना आवश्यक है, जो परिणामों को अधिक सटीक बना देगा।

5. अनुलग्नक वी-आईएफ 647 और पीआई प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रकाश से बचें। प्रतिक्रिया के बाद जितनी जल्दी हो सके परीक्षण किया जाना चाहिए।

6. प्रदूषण से बचने और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान प्रयोगशाला कपड़े और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।

यह उत्पाद केवल नैदानिक ​​निदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए है!

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