एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

उत्पाद की जानकारी:

उत्पाद वर्णन:

एपोप्टोसिस एक सामान्य शारीरिक प्रक्रिया है जो भ्रूण विकास और ऊतक होमियोस्टेसिस के रखरखाव की प्रक्रिया में होती है। यह कई morphological परिवर्तनों के साथ है। उनमें से, सेल झिल्ली का नुकसान एपोप्टोसिस की शुरुआती विशेषताओं में से एक है। सामान्य कोशिकाओं में, फॉस्फोटीडिलसेरिन (पीएस) केवल सेल झिल्ली के फॉस्फोलिपिड बिलायर के आंतरिक पक्ष पर वितरित किया जाता है। हालांकि, एपोप्टोसिस के शुरुआती चरण में, पीएस लिपिड झिल्ली के बाहरी तरफ से बाहरी पक्ष तक फ़्लिप करेगा, इसे सेल के बाहर उजागर करेगा। एनेक्सिन वी (एनेक्सिन वी) एक सीए 2 +-निर्भर फॉस्फोलिपिड बाध्यकारी प्रोटीन है जिसमें पीएस के लिए उच्च संबंध है और विशेष रूप से पीएस के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं को बांधता है। इसलिए, अनुलग्नक वी का उपयोग प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए संकेतकों में से एक के रूप में किया जाता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एक न्यूक्लिक एसिड डाई है। यह तीव्र कोशिका झिल्ली और प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है, लेकिन देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के सेल झिल्ली में प्रवेश कर सकता है और नाभिक दाग सकता है।

यह उत्पाद प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एक पहचान जांच के रूप में एनेक्सिन वी को लेबल करने के लिए एफआईटीसी का उपयोग करता है। साथ ही, पीआई का उपयोग नेक्रोटिक और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। अनुलग्नक वी-एफआईटीसी और पीआई का संयुक्त उपयोग, लाइव कोशिकाएं नकारात्मक धुंधला दिखाती हैं (अनुलग्नक वी- / पीआई-), प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं एकल फ्लोरोसेंस पॉजिटिव (अनुलग्नक वी + पीआई-) दिखाती हैं, और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाएं दोहरी प्रतिदीप्ति सकारात्मक दिखाती हैं (Annexin V + / PI +)। यह किट प्रवाह साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप पहचान के लिए उपयुक्त है।

भंडारण और परिवहन

आइस बैग (गीला बर्फ) परिवहन;

यह किट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है और 12 महीने की वैधता अवधि है।

अवयव:

ऑपरेशन कदम:

1. निलंबन कोशिकाएं: सेल निलंबन लें, और सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 500 ग्राम पर 5 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें;

अनुवर्ती कोशिकाएं: पहले सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्रित करें। ईडीटीए-फ्री ट्रिप्सिन (जी 4002 अनुशंसित) के साथ पाचन के बाद, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन करें, और 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें। ट्राप्सिन पाचन समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए, ताकि अत्यधिक पाचन से बचें और झूठी सकारात्मक कारण बन सकें।

2. पूर्व-ठंडा पीबीएस (जी 4202 अनुशंसित) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और प्रत्येक बार 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें;

3. धीरे-धीरे पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर में कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें और सेल एकाग्रता को 1 ~ 5 × 106 / मिलीलीटर समायोजित करें;

4. सेल निलंबन के 100 μl लें, 5 μl Annexin वी-एफआईटीसी और 5 μl पीआई जोड़ें, धीरे-धीरे मिश्रण करें, और कमरे के तापमान पर प्रकाश से 8-10 मिनट के लिए सुरक्षित रखें;

5. पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर के 400 μl जोड़ें, धीरे-धीरे हिलाएं, और 1 एच के भीतर प्रवाह साइटोमीटर या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के साथ पहचान करें।

परिणाम विश्लेषण

1. प्रवाह साइटोमेट्री

ए। उपयुक्त वोल्टेज का चयन करें और प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के दौरान हल्के मुआवजे को समायोजित करें। प्रयोगात्मक समूह को छोड़कर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण (एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और पीआई लेबल के बिना) सेट करने की सिफारिश की जाती है, और एक एकल लेबल नियंत्रण (केवल अनुलग्नक जोड़ा जाता है)। वी-एफआईटीसी और पीआई-केवल कोशिकाओं) को समायोजित और क्षतिपूर्ति के लिए उपयोग किया जाता है;

बी। प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के संदर्भ उदाहरण:

जुर्कैट टी लिम्फोमा कोशिकाएं 6 घंटे के लिए 5 माइक्रोन कैम्पटोथेसिन के साथ प्रेरित थीं। उपरोक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया का संदर्भ लें और परिणामों का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें। परिणाम नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाए जाते हैं।

एफआईटीसी की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 488 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 525 एनएम है; पीआई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 535 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 615 एनएम है। दो फैलाव बिंदु आरेख प्रवाह साइटोमीटर के प्रासंगिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा खींचा गया था, और एफआईटीसी एब्सिसा पर था और पीआई आदेश पर था। एक ठेठ प्रयोग में, जीवित कोशिकाओं में कोई फ्लोरोसेंस नहीं होता है, और बिखरे हुए बिंदु निचले बाएं के पहले चतुर्भुज में होते हैं। शुरुआती चरण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं में मजबूत हरी प्रतिदीप्ति होती है, और बिखरे हुए बिंदु निचले दाएं के दूसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं। देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाएं लाल और हरे रंग के डबल फ्लोरोसेंस दिखाती हैं, और बिखरे हुए बिंदु ऊपरी दाएं के तीसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं।

2. फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप निरीक्षण

ग्लास स्लाइड पर एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और पीआई के साथ सेल सस्पेंशन के 5-10 μl जोड़ें, एक कवर ग्लास के साथ कवर, और दो रंगीन फ़िल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। Annexin वी-एफआईटीसी एक हरे रंग के फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रस्तुत करता है। पीआई में एक लाल फ्लोरोसेंट सिग्नल है।

ध्यान दें:

1. पूरे प्रयोग के दौरान, ऑपरेशन सेल टूटने से बचने के लिए जितना संभव हो सके कोमल होना चाहिए और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करना चाहिए।

2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोना नहीं छोड़ा जा सकता है, और साथ ही, जितना संभव हो सके अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें।

3. कोशिकाओं को पचाने के लिए ट्राप्सिन का उपयोग करते समय, आपको कोशिकाओं को कृत्रिम क्षति से बचने और पाचन समय को नियंत्रित करने के लिए सावधान रहना चाहिए। यदि पाचन समय बहुत छोटा है, तो कोशिकाओं को गिरने के लिए उड़ाया जाना चाहिए, जो कोशिका झिल्ली को यांत्रिक क्षति का कारण बन सकता है; यदि पाचन समय बहुत लंबा है, तो सेल झिल्ली भी क्षति के लिए कमजोर है। परीक्षण परिणामों को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, ईडीटीए युक्त पैनक्रेटिन का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ईडीटीए अनुलग्नक वी और पीएस के बाध्यकारी को प्रभावित करेगा।

4. अनुपालन कोशिकाओं को एपोप्टोसिस द्वारा उत्तेजित करने के बाद, यदि कुछ कोशिकाएं तैरती हैं, तो सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और अनुवर्ती कोशिकाओं को इकट्ठा करना और एक ही समय में उन्हें दागना आवश्यक है, जो परिणामों को अधिक सटीक बना देगा।

5. एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और पीआई प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रकाश से बचें। प्रतिक्रिया के बाद जितनी जल्दी हो सके परीक्षण किया जाना चाहिए।

6. प्रदूषण से बचने और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान प्रयोगशाला कपड़े और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।