एनेक्सिन वी-पीई / 7-एएडी सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

उत्पाद की जानकारी:

उत्पाद वर्णन:

एपोप्टोसिस एक सामान्य शारीरिक प्रक्रिया है जो भ्रूण विकास और ऊतक होमियोस्टेसिस के रखरखाव की प्रक्रिया में होती है। यह कई morphological परिवर्तनों के साथ है। उनमें से, सेल झिल्ली का नुकसान एपोप्टोसिस की शुरुआती विशेषताओं में से एक है। सामान्य कोशिकाओं में, फॉस्फोटिडाइलेरिन (पीएस) केवल सेल झिल्ली के फॉस्फोलिपिड बिलायर के भीतरी तरफ वितरित किया जाता है, लेकिन एपोप्टोसिस के शुरुआती चरण में, पीएस लिपिड झिल्ली के बाहरी पक्ष से बाहरी पक्ष तक बाहर निकल जाएगा, इसे उजागर करेगा सेल के बाहर। Annexin v (Annexin v) एक Ca2 +-निर्भर फॉस्फोलाइपिड-बाध्यकारी प्रोटीन है जो पीएस के लिए उच्च संबंध के साथ है और विशेष रूप से पीएस के संपर्क में कोशिकाओं को बांधता है। इसलिए, अनुलग्नक वी का उपयोग प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए संकेतकों में से एक के रूप में किया जाता है। 7-एएडी एक न्यूक्लिक एसिड डाई है जो केवल एपोप्टोटिक और मृत कोशिकाओं के सेल झिल्ली में प्रवेश कर सकता है और देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए नाभिक को दाग सकता है।

यह उत्पाद प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एक पहचान जांच के रूप में अनुलग्नक वी लेबल करने के लिए PHYCOERYTHRIN (PHYCOERYTHRIN, पीई) का उपयोग करता है। उसी समय, 7-एएडी का उपयोग नेक्रोटिक और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से जीवित रहने की कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। अनुलग्नक वी-पीई और 7-एएडी का संयुक्त उपयोग, लाइव कोशिकाएं नकारात्मक धुंधला दिखाती हैं (अनुलग्नक वी- / 7-एएडी-), प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं एकल फ्लोरोसेंस पॉजिटिव (एनेक्सिन वी + / 7-एएडी-) दिखाती हैं, और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाओं ने डबल फ्लोरोसेंस पॉजिटिव (एनेक्सिन वी + / 7-एएडी +) दिखाया। यह किट प्रवाह साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप पहचान के लिए उपयुक्त है।

भंडारण और परिवहन

गीले बर्फ में परिवहन;

अंधेरे में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, 12 महीने के लिए मान्य।

अवयव:

ऑपरेशन कदम:

1. निलंबन कोशिकाएं: सेल निलंबन लें, और सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 500 ग्राम पर 5 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें;

अनुवर्ती कोशिकाएं: पहले सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्रित करें। ईडीटीए मुक्त ट्रिप्सिन (जी 4002 अनुशंसित) के साथ पाचन के बाद, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन करें, और 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें। ट्राप्सिन पाचन समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए, ताकि अत्यधिक पाचन से बचें और झूठी सकारात्मक कारण बन सकें।

2. पूर्व-ठंडा पीबीएस (जी 4202 अनुशंसित) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और प्रत्येक बार 500 ग्राम पर 500 ग्राम पर 500 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्रित करें;

3. धीरे-धीरे पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर में कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें और सेल एकाग्रता को 1 ~ 5 × 106 / मिलीलीटर समायोजित करें;

4. सेल निलंबन के 100 μl लें, 5 μl annexin v-pe और 5 μl 7-aad जोड़ें, धीरे-धीरे मिश्रण करें, और कमरे के तापमान पर प्रकाश से रक्षा 8-10 मिनट के लिए;

5. पूर्व-ठंडा 1 × बाध्यकारी बफर के 400 μl जोड़ें, धीरे-धीरे हिलाएं, और 1 एच के भीतर प्रवाह साइटोमीटर या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के साथ पहचान करें।

परिणाम विश्लेषण

1. प्रवाह साइटोमेट्री

ए। उपयुक्त वोल्टेज का चयन करें और प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के दौरान हल्के मुआवजे को समायोजित करें। समायोजन और मुआवजे के लिए वोल्टेज और एकल-लेबल नियंत्रण (केवल एनेक्सिन वी-पीई और केवल 7-एएडी जोड़ें) को समायोजित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण (बिना किसी मार्कर के) सेट करने की सिफारिश की जाती है;

बी। प्रवाह साइटोमेट्री पहचान और विश्लेषण के संदर्भ उदाहरण:

जुरकैट टी लिम्फोमा कोशिकाएं 6 एच के लिए 5 माइक्रोन कैम्पटोथेकिन के साथ प्रेरित थीं। उपरोक्त प्रयोगात्मक प्रक्रिया का संदर्भ लें और परिणामों का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें। परिणाम नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाए जाते हैं।

पीई की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 565 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 578 एनएम है; 7-एएडी की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 546 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 647 एनएम है। दो फैलाव बिंदु आरेख प्रवाह साइटोमीटर के प्रासंगिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा खींचा गया था, पीई के साथ पीई के साथ और समन्वय पर 7-एएडी। एक ठेठ प्रयोग में, जीवित कोशिकाओं में कोई फ्लोरोसेंस नहीं होता है, और बिखरे हुए बिंदु निचले बाएं के पहले चतुर्भुज में होते हैं। शुरुआती चरण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं में मजबूत नारंगी-लाल फ्लोरोसेंस होता है, और बिखरे हुए बिंदु निचले दाएं के दूसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं। देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं और नेक्रोटिक कोशिकाएं नारंगी-लाल और गुलाबी डबल फ्लोरोसेंस पेश करती हैं, और बिखरे हुए बिंदु ऊपरी दाएं के तीसरे चतुर्भुज में स्थित होते हैं।

2. फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप निरीक्षण

ग्लास स्लाइड पर एनेक्सिन वी-पीई और 7-एएडी के साथ सेल निलंबन के 5-10 μl जोड़ें, एक कवर ग्लास के साथ कवर, और दो रंगीन फ़िल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। एनेक्सिन वी-पीई नारंगी-लाल फ्लोरोसेंट सिग्नल है, 7-एएडी गुलाबी फ्लोरोसेंट सिग्नल है।

टिप्पणियाँ:

1. पूरे प्रयोग के दौरान, ऑपरेशन सेल टूटने से बचने के लिए जितना संभव हो सके कोमल होना चाहिए और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करना चाहिए।

2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोना नहीं छोड़ा जा सकता है, और साथ ही, जितना संभव हो सके अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें।

3. कोशिकाओं को पचाने के लिए ट्राप्सिन का उपयोग करते समय, आपको कोशिकाओं को कृत्रिम क्षति से बचने और पाचन समय को नियंत्रित करने के लिए सावधान रहना चाहिए। यदि पाचन समय बहुत छोटा है, तो कोशिकाओं को गिरने के लिए उड़ाया जाना चाहिए, जो कोशिका झिल्ली को यांत्रिक क्षति का कारण बन सकता है; यदि पाचन समय बहुत लंबा है, तो सेल झिल्ली भी क्षति के लिए कमजोर है। परीक्षण परिणामों को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, ईडीटीए युक्त पैनक्रेटिन का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ईडीटीए अनुलग्नक वी और पीएस के बाध्यकारी को प्रभावित करेगा।

4. अनुपालन कोशिकाओं को एपोप्टोसिस द्वारा उत्तेजित करने के बाद, यदि कुछ कोशिकाएं तैरती हैं, तो सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और अनुवर्ती कोशिकाओं को इकट्ठा करना और एक ही समय में उन्हें दागना आवश्यक है, जो परिणामों को अधिक सटीक बना देगा।

5. एनेक्सिन वी-पीई और 7-एएडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रकाश से बचें। प्रतिक्रिया के बाद जितनी जल्दी हो सके परीक्षण किया जाना चाहिए।

6. प्रदूषण से बचने और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान प्रयोगशाला कपड़े और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।

यह उत्पाद केवल नैदानिक ​​निदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए है!