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क्लिक-इट एडु -488 सेल प्रसार पहचान किट

मात्रा: 100 टी

उपलब्धता स्थिति:
  • G1601
  • Servicebio

उत्पाद वर्णन

उत्पाद का परिचय:

यह सेल प्रसार क्षमता का विश्लेषण करके या अलग-अलग ऊतक कोशिकाओं की वृद्धि और नवीनीकरण क्षमता का विश्लेषण करके विभिन्न जीनों, दवाओं आदि के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए जीवन विज्ञान में एक सामान्य और महत्वपूर्ण मूल्यांकन विधि है। परिस्थितियों या उत्तेजना हस्तक्षेप। । सेल प्रसार का पता लगाने के लिए कई विधियां हैं। उनमें से अधिकतर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कुछ चयापचय एंजाइमों का उपयोग करते हैं ताकि कोशिकाओं की प्रसार गतिविधि (जैसे सीसीके -8 विधि, एमटीटी विधि, आदि) का आकलन किया जा सके, लेकिन सेल की स्थिति जैसे कुछ दवाओं या कारकों का एक निश्चित होगा मूल्यांकन के परिणामों पर प्रभाव। कोशिका प्रसार निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं में डीएनए संश्लेषण का प्रत्यक्ष पहचान सबसे सटीक और प्रभावी पहचान विधि के रूप में पहचानी जाती है। हालांकि, मूल रेडियोलैबेड न्यूक्लियोसाइड इनकॉर्पोरेशन विधि और एंटीबॉडी डिटेक्शन के आधार पर ब्रॉडयू विधि के बाद के सुधार की अपनी सीमाएं हैं।

एडू (5-एथिनिल -2'-deoxyuridine, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine) एक थाइमिडाइन एनालॉग है जिसमें एक एसिटिलेन समूह होता है, जब जानवरों में इंजेक्शन या विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं को उजागर किया जाता है, तो ये छोटे अणुओं को विभिन्न अंगों में तेजी से फैल सकता है और ऊतक, और कोशिकाओं में घुसपैठ करते हैं, और सेल प्रसार के दौरान नए संश्लेषित डीएनए में थाइमिडाइन (टी) को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। एडू अणु में एसिटिलीन समूह तांबा आयनों के उत्प्रेरण के तहत एक स्थिर ट्राइजोल अंगूठी बनाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एज़ाइड यौगिक जांच के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, इसलिए नए संश्लेषित डीएनए को संबंधित फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया जा सकता है। रेडियोलैबल्ड न्यूक्लियोसाइड इनकॉर्पोरेशन विधि की तुलना में, एडू डिटेक्शन विधि में रेडियोधर्मी संदूषण जैसे सीमित कारक नहीं हैं; ब्रॉडयू पहचान विधि की तुलना में, ईडीयू डिटेक्शन विधि को डीएनए denaturation उपचार या एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रयोग और समय की जटिलता को बहुत कम करता है, यह भी अधिक समय-बचत, अधिक संवेदनशील, अधिक स्थिर और अधिक सटीक हो जाता है । इस किट का उपयोग विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं या पशु ऊतकों में सेल प्रसार का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस किट में फ्लोरोसेंट जांच हरी फ्लोरोसेंस है, अधिकतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 491 एनएम है, और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 516 एनएम है। प्रजनन कोशिकाओं के लेबल के बाद, सेल नाभिक चमकदार हरी प्रतिदीप्ति दिखाएगा। सेल न्यूक्लियस को संयुक्त रूप से मिलान पारंपरिक परमाणु डाई के साथ लेबल किया जाता है (यह किट होचस्ट 33342 सेल परमाणु डाई प्रदान करता है, आप फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप, लेजर confocal माइक्रोस्कोप और अन्य उपकरणों का उपयोग सीधे सेल प्रसार का निरीक्षण करने के लिए कर सकते हैं; आप विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं की फ्लोरोसेंस तीव्रता का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का भी उपयोग कर सकते हैं, और मध्य-स्तर के चरण में फ्लोरोसेंस तीव्रता डीएनए प्रतिकृति गतिविधि के आधार पर सेल चक्र का न्याय कर सकते हैं।

भंडारण और परिवहन

गीले बर्फ में ले जाया गया; अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, ईडीयू उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए) और प्रतिक्रिया बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; 12 महीने के लिए मान्य।

घटक संख्या

अवयव

G1601-100T

G1601-1

एडू भंडारण समाधान (10 मिमी)

100 μl

G1601-2

उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए)

120 μl

G1601-3

फ्लोरोसेंट डाई IF488 (अभिकर्मक बी)

50 μl

G1601-4

उत्प्रेरक additives (अभिकर्मक सी)

2 × 100 मिलीग्राम (पाउडर)

G1601-5

रिएक्शन बफर

20 मिलीलीटर

G1601-6

होचस्ट 33342 धुंधला समाधान

30 μl

उत्पाद उपयोगकर्ता पुस्तिका

1 पीसी

नोट: उपरोक्त प्रतिक्रिया समय 96-अच्छी प्लेट पहचान के अनुरूप है।

प्रयोग तैयारी

1. सेल संस्कृति माध्यम जिसमें सीरम होता है;

2. पारगम्यता समाधान: 0.2-0.5% ट्राइटन एक्स -100 (जी 1204 की सिफारिश की गई है) युक्त बफर समाधान;

3. फिक्सिंग समाधान: 4% पैराफॉर्मल्डेहाइड (जी 1101 अनुशंसित) या समान उद्देश्यों के लिए अन्य अभिकर्मक;

4. पीबीएस बफर (जी 4202 की सिफारिश की है);

5. अल्ट्रा-शुद्ध पानी;

6. पशु मॉडलिंग और ऊतक अनुभाग संबंधित अभिकर्मकों (पशु ऊतक सेल प्रसार का पता लगाने)।

ऑपरेशन कदम:

1. इन विट्रो सेल नमूने और अभिकर्मकों की तैयारी:

1.1। कोशिकाओं को एक निश्चित घनत्व पर सेल संस्कृति प्लेट में समान रूप से संयोजित करें (रोपण घनत्व कोशिका आकार, विकास की गति इत्यादि जैसे कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है)। कोशिकाओं की दीवार का पालन करने या सामान्य स्थिति में लौटने के बाद, संबंधित दवा उत्तेजना और अन्य उपचार (जैसे निलंबन कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए, कृपया निलंबन कोशिकाओं की सामान्य संचालन विधि का पालन करें, पूरे प्रयोग को सेंट्रीफ्यूगेशन जैसे चरणों को जोड़ने की आवश्यकता है)।

1.2। कम गति पर उत्प्रेरक additive (अभिकर्मक सी) अपकेंद्रित्र, इसे भंग करने के लिए ultrapure पानी के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और बाद में उपयोग के लिए इसे -20 ℃ पर स्टोर करें।

2. विट्रो में कोशिकाओं के एडीयू लेबलिंग, निर्धारण और पारगम्यता:

2.1। तैयार 2 × edu ऊष्मायन कार्य समाधान: पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के प्रत्येक 1 मिलीलीटर को 2 μl edu भंडारण समाधान (10 मिमी) जोड़ें, जो 20 माइक्रोन 2 × edu ऊष्मायन कार्य समाधान है, और इसे इनक्यूबेटर में पहले से गरम करने के लिए रखता है (यह है) अनुशंसा की जाती है कि पूर्व प्रयोग को 10 माइक्रोन की कामकाजी एकाग्रता के साथ खोजा जाना चाहिए;

2.2। आधा बदलते माध्यम के तरीके में, संस्कृति प्लेट में मूल सेल संस्कृति माध्यम का आधा आकांक्षा करें, और पहले से गरम 2 × edu ऊष्मायन कार्य समाधान की समान मात्रा जोड़ें, और एक निश्चित अवधि के लिए सेते हैं (ऊष्मायन समय आम तौर पर निर्भर करता है संबंधित सेल वृद्धि पर चक्र आमतौर पर सेल चक्र समय के लगभग 10% के लिए खाते हैं। अधिकांश अनुवर्ती और तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के लिए, लगभग 2 घंटे तक सेते हैं। विशिष्ट स्थितियों के लिए, इसे समायोजित करने की आवश्यकता है उपचार के बाद सेल विशेषताओं और वास्तविक परिस्थितियों। यदि अधिक ऊष्मायन की आवश्यकता है तो समय उचित रूप से ईडीयू कामकाजी एकाग्रता को कम कर सकता है; कम समय के लिए, ईडीयू एकाग्रता को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है);

2.3। ईडीयू लेबल वाले सेल नमूने के बाद पीबीएस बफर के साथ 1-2 बार के लिए धोया जाता है, कोशिकाओं को कवर करने के लिए फिक्सेटिव समाधान जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ठीक करें (यदि प्रवाह का पता लगाने की आवश्यकता होती है, तो इस चरण से पहले कोशिकाओं का पालन करें पाचन और resuspension, इसे ठीक करें, और फिर निलंबन सेल प्रसंस्करण विधि का पालन करें); पीबीएस बफर के साथ 2-3 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट के लिए;

2.4। पीबीएस बफर को हटाएं, कोशिकाओं या ऊतकों को कवर करने के लिए पारगम्य जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं;

2.5। पारगम्य को हटाने के बाद, प्रत्येक बार 3-5 मिनट के लिए पीबीएस बफर के साथ 1-2 बार धोएं, और फिर चरण 4 पर जाएं।

3. पशु edu इंजेक्शन मॉडलिंग और ऊतक अनुभाग प्रसंस्करण:

3.1। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के मुताबिक, एक या अधिक ईडीयू इंजेक्शन का उपयोग इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, इंट्रामस्क्यूलर इंजेक्शन, उपकरणीय इंजेक्शन, पूंछ नस इंजेक्शन इत्यादि द्वारा जानवरों के मॉडल के लिए किया जाता है, आम तौर पर, ईडीयू खुराक का अनुपात पशु शरीर के वजन के अनुपात में 5 मिलीग्राम / किग्रा होता है। विशिष्ट इंजेक्शन राशि अनुसंधान सामग्री और पशु परिस्थितियों पर निर्भर करती है। इस किट में एडू स्टोरेज समाधान का हिस्सा प्रदान किया जाता है, जिसका मुख्य रूप से विट्रो सेल एडू लेबलिंग के लिए उपयोग किया जाता है। यदि आपको ईडीयू के साथ जानवरों को मॉडल करने की ज़रूरत है, तो आप एडू अभिकर्मक को अलग से ऑर्डर कर सकते हैं (जी 505 9 की सिफारिश की जाती है);

3.2। छोटी आंत और अन्य उपकला ऊतक कोशिकाएं तेजी से बढ़ती हैं, और मस्तिष्क ऊतक कोशिकाएं धीरे-धीरे फैलती हैं। तेजी से बढ़ते ऊतक आमतौर पर 12 घंटे से भी कम समय लेते हैं, जबकि धीमे उगाने वाले ऊतक को कई दिन लग सकते हैं; सबसे अच्छा अंकन समय विशिष्ट प्रयोग के आधार पर आधारित है, क्योंकि छोटे आंतों के उपकला ऊतक जल्दी से बढ़ते हैं, इस प्रकार के ऊतक को लेबल संदर्भ के रूप में उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है;

3.3। निर्धारित मानकों के अनुसार मॉडल किए गए जानवरों को मौत के लिए रखा जाता है, आवश्यक ऊतकों को बाहर निकाला जाता है, और जमे हुए खंड या पैराफिन अनुभाग पारंपरिक प्रक्रियाओं के अनुसार किए जाते हैं;

ए। जमे हुए वर्गों के लिए: कमरे के तापमान पर लौटें, फिक्सेटिव की उचित मात्रा जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें। फिक्सेटिव को हटा दें और 3-5 मिनट के लिए पीबीएस बफर की उचित मात्रा के साथ 3 बार धोएं; पीबीएस बफर को हटा दें और ऊतक को उचित रूप से पारगम्यता समाधान के साथ कवर करें और कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए सेते हैं; पारगम्यता समाधान निकालें और पीबीएस बफर -2 गुना, हर बार 3-5 मिनट के साथ 1 धोएं, फिर चरण 4 पर जाएं।

बी। पैराफिन खंडों के लिए: अनुभागों को deparaffinize और पुन: व्यवस्थित करें और 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धो लें। पीबीएस बफर को हटाएं, कोशिकाओं या ऊतकों को कवर करने के लिए पारगम्य जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं; पारगम्य को हटाने के बाद, प्रत्येक बार 3-5 मिनट के लिए पीबीएस बफर के साथ 1-2 बार धोएं, और फिर चरण 4 पर जाएं।

4. एडू क्लिक प्रतिक्रिया:

4.1। सेल या ऊतक निर्धारण और छिद्रण के दौरान, क्लिक प्रतिक्रिया समाधान तैयार करें (विभिन्न नमूना तैयारी प्रणाली के लिए, नीचे दी गई तालिका में योजना देखें)

विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए: यह संदर्भ चरण 10 96-अच्छी प्लेट नमूने (100 μl प्रति अच्छी तरह से) की मात्रा और खुराक से मेल खाता है। उपयोग की आवश्यकताओं के अनुपात में तैयारी की राशि में वृद्धि या कमी की जा सकती है। कृपया नीचे दी गई तालिका में दिखाए गए क्रम में घटकों को जोड़ें। पक्ष जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं (तैयार और अब उपयोग किया गया);

अवयव

आयतन

रिएक्शन बफर

935 μl

उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए)

10 μl

फ्लोरोसेंट डाई IF488 (अभिकर्मक बी)

5 μl

उत्प्रेरक additives (अभिकर्मक सी)

50 μl

कुल क्षमता

1000 μl

ऊतक सेल स्लाइस के लिए: क्लिक प्रतिक्रिया समाधान प्रणाली की तैयारी के लिए निम्न प्रणाली का संदर्भ लें। कटौती नमूने की संख्या के अनुपात में तैयारी की राशि में वृद्धि या कम किया जा सकता है। प्रत्येक स्लाइस नमूना क्लिक प्रतिक्रिया समाधान के लगभग 100-200 μl के साथ कवर किया गया है।

अवयव

आयतन

रिएक्शन बफर

928 μl

उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए)

10 μl

फ्लोरोसेंट डाई IF488 (अभिकर्मक बी)

12 μl

उत्प्रेरक additives (अभिकर्मक सी)

50 μl

कुल क्षमता

1000 μl

4.2। पिछले चरण के पीबीएस बफर को हटाएं (चरण 2.5 या 3.3), क्लिक प्रतिक्रिया समाधान जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे हिलाएं कि प्रतिक्रिया समाधान सभी कोशिकाओं या ऊतकों को कवर करता है, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं;

4.3। क्लिक प्रतिक्रिया समाधान को हटा दें और प्रत्येक बार 3-5 मिनट के लिए पीबीएस बफर के साथ 2-3 बार धो लें (यदि कोई अन्य विशेष आवश्यकता नहीं है, तो आप फ्लोरोसेंस तीव्रता का पता लगाने या फ्लोरोसेंस प्रभाव का पता लगाने के लिए अन्य उपकरणों का उपयोग करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर सकते हैं) ।

5. परमाणु धुंधला:

5.1। पिछले चरण में पीबीएस बफर निकालें, होचस्ट 33342 धुंधला समाधान और पीबीएस बफर को 1: 500-1000 के अनुपात में पतला करें, कवरिंग कोशिकाएं जोड़ें, और 5 मिनट के लिए सेते हैं;

5.2। होचस्ट 33342 धुंधला समाधान निकालें, और प्रत्येक बार 3-5 मिनट के लिए पीबीएस बफर के साथ 2-3 बार धो लें।

6. इमेजिंग और पहचान विश्लेषण

एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप या एक confocal माइक्रोस्कोप में सुसंस्कृत कोशिकाओं या ऊतक टुकड़े नमूने सीधे कोशिकाओं के अनुपात के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए रखें; या विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं को एकत्रित करें और फ्लोरोसेंस तीव्रता का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें (यह एड्यू लेबल वाला सेल नमूना का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है, प्रवाह साइटोमेट्री का पता लगाने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, और उपयुक्त वोल्टेज का चयन किया जाता है)। फ्लोरोसेंस तीव्रता के अनुसार, सेल चक्र के एस चरण में डीएनए प्रतिकृति गतिविधि का फैसला किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट डाई IF488 (अभिकर्मक बी) की इसी वर्णक्रमीय विशेषताएं इस किट में पूर्व / ईएम: 491 एनएम / 516 एनएम (हरा) हैं; होचस्ट 33342 धुंधला समाधान की इसी वर्णक्रमीय विशेषताओं पूर्व / ईएम: 346 एनएम / 460 एनएम (नीला) हैं।

टिप्पणियाँ:

1. विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, विशिष्ट ईडीयू एकाग्रता और ऊष्मायन समय को नमूना और अनुसंधान के उद्देश्य के आधार पर उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है।

2. कुछ ऊतक कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ती हैं। खराब मॉडलिंग प्रभाव जैसे कारकों को खत्म करने के लिए, संदर्भ नमूने (जैसे आंतों के ऊतक) के रूप में तेजी से प्रसार के साथ ऊतक नमूने का चयन करने की अनुशंसा की जाती है।

3. यदि पृष्ठभूमि रंग बहुत अंधेरा है, तो यह प्रयोग में अपर्याप्त धुलाई, बहुत लंबे ऊतक नमूना निर्धारण समय, और अवशिष्ट निर्धारण के कारण हो सकता है।

4. ईडीयू उत्प्रेरक जोड़ अभिकर्मक (अभिकर्मक सी) ऑक्सीकरण करना आसान है। हवा के लिए लंबे समय तक संपर्क से बचने की कोशिश करें। एक जलीय घोल में तैयार होने के बाद, इसे अलगाव में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है; परीक्षण के बाद, यदि ईडीयू उत्प्रेरक अतिरिक्त अभिकर्मक का रंग थोड़ा बदल जाता है, तो क्लिक प्रतिक्रिया उत्प्रेरक प्रणाली समान रहती है, यह सामान्य रूप से आगे बढ़ सकती है। यदि यह भूरा प्रतीत होता है, तो यह इंगित करता है कि घटक समाप्त हो गया है, इसलिए कृपया इसे छोड़ दें।

5. ऑपरेशन के दौरान कृपया प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।

यह उत्पाद केवल नैदानिक ​​निदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए है!

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