जी 1073-100 टी उम्र बढ़ने सेल β-galactosidase धुंधला किट

उपयोग:

1. रीजन तैयारी

(1) अपने स्वयं के पीबीएस बफर समाधान की तैयारी।

(2) एक्स-गैल पाउडर 100 मिलीग्राम को अच्छी तरह से भंग कर दिया गया था और एक्स-गैल समाधान प्राप्त करने के लिए 5 मिलीलीटर डीएमएफ के साथ मिश्रित किया गया था, जिसे तब प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में विभाजित किया गया था और प्रकाश से -20 ℃ दूर -20 ℃ में संग्रहीत किया गया था।

(3) डाइंग समाधान नीचे दी गई तालिका में दिखाए गए अनुपात में तैयार किया गया था:

2. धुंधला कदम

(1) अनुवर्ती सेल के लिए

ए) 6 अच्छी तरह से प्लेटों (या सेल स्लाइड) में सुसंस्कृत कोशिकाएं कोशिका संस्कृति माध्यम से चूस गईं, पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, फिर 1 मिलीलीटर β-galactosidase धुंधला निर्धारण समाधान जोड़ा गया, और 15min के लिए कमरे के तापमान पर तय किया गया।

बी) निश्चित समाधान को त्याग दिया गया था और कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3 गुना, 2 मिनट के लिए धोया गया था

सी) पीबीएस को जितना संभव हो सके बाहर कर दिया गया था, प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर धुंधला समाधान जोड़ा गया था, और रातोंरात तक 2 एच के लिए 37 ℃ पर सेते थे। नोट: 37 ℃ कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में सेते न हों। धुंधला होना चाहिए, रंग विकास होना चाहिए समय में मनाया जा सकता है। यदि नमूना में β-galactosidase की अभिव्यक्ति उच्च है, धुंधला कुछ घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है। अगर β-galactoside एंजाइम की अभिव्यक्ति कम है, ऊष्मायन समय उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए, जिसके दौरान 6-अच्छी प्लेट चाहिए तरल की वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लास्टिक की चादर या पैराफिलम के साथ सील किया जा सकता है।

डी) सामान्य प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन। अगर समय पर निरीक्षण करना और गिनना संभव नहीं है, धुंधला काम करने वाले तरल पदार्थ को हटाया जा सकता है, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया जा सकता है, और फिर 2 मिलीलीटर पीबीएस को जोड़ा जा सकता है और 1 सप्ताह में 1 सप्ताह के लिए जोड़ा जा सकता है और संग्रहीत किया जा सकता है ℃ .or, धुंधला तरल पदार्थ को हटाने के बाद, कोशिकाओं को ढंकने के लिए 70% ग्लिसरीन जोड़ें, और कोशिकाओं को लंबे समय तक 4 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है। अगर यह एक सेल स्लाइड है, तो इसे ढाल इथेनॉल द्वारा निर्जलित किया जा सकता है और फिर ड्रिप किया जा सकता है संरक्षण के लिए स्थायी स्लाइस में बने सीलबंद टैबलेट।

(2) जमे हुए खंड के लिए

ए) जमे हुए खंड कमरे के तापमान पर 10min के लिए संतुलित थे। एक रचना स्ट्रोक के साथ ऊतक को बचाते हैं।

बी) β-galactosidase धुंधला निर्धारण समाधान की एक उचित मात्रा ऊतक को ऊतक को पूरी तरह से कवर करने और 20min के लिए कमरे के तापमान पर तय करने के लिए जोड़ा गया था।

सी) ऊतक खंड भिगोकर पीबीएस द्वारा 3 गुना, 5min प्रत्येक के लिए धोया गया था।

डी) अनुभाग को हल्के-सबूत गीले बॉक्स में रखा गया है, और ऊतक को पूरी तरह से कवर करने के लिए ऊतक में धुंधला समाधान की उचित मात्रा में जोड़ा जाता है। गीला बॉक्स 37 ℃ पर सेते थे, और माइक्रोस्कोप के तहत रंग प्रतिपादन मनाया गया था हर 2 एच। यदि कोई रंग प्रतिपादन नहीं देखा गया था, तब तक ऊष्मायन तब तक जारी रखा गया था जब तक कि सीनेइल कोशिकाओं ने ऊतक पर रंग नहीं दिखाया। अगर नमूना रातोंरात से ऊष्मायन किया जाना है, तो तरल पदार्थ को वाष्पीकरण से रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा में रंगाई समाधान जोड़ा जाना चाहिए।

ई) ऊतक रंग विकसित होने के बाद, धुंधला समाधान हटा दिया गया था, और वर्गों को दो बार के लिए पीबीएस में भिगो दिया गया था और दो बार शुद्ध पानी में भिगो दिया गया था

एफ) परमाणु ठोस लाल डाई की बूंदों को 3min के लिए जोड़ा गया था और 3 गुना के लिए धोया गया था। यह कदम आवश्यक नहीं है। अगर न्यूक्लियस को दागने की जरूरत है, तो हम अपने परमाणु निर्धारण लाल डाई (जी 1035) का उपयोग कर सकते हैं।

जी) निर्जलीय इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण 2 गुना, 5min प्रत्येक, 5min के लिए Xylene पारदर्शी, और फिर टुकड़े को सील करने के लिए तटस्थ गम छोड़ दें।

धुंधला परिणाम:

सेनेंट कोशिकाएं नीली होती हैं।

दंतकथा:

Fig.1 वाई -38 कोशिकाएं β-galactoside किट द्वारा दागी थीं। बाईं ओर का आंकड़ा विभेदक वाई -38 कोशिकाओं को विभाजन और प्रसार क्षमता के बिना दिखाता है लेकिन अभी भी जीवित है। धुंधला होने के बाद सकारात्मक धुंधला कोशिकाएं 95% से अधिक होती हैं। दाईं ओर की छवि नए पुनर्जीवित वाई -38 कोशिकाओं को 3 से कम से कम (प्रारंभिक मार्ग) और धुंध के बाद कोई महत्वपूर्ण सकारात्मक कोशिकाओं के साथ दिखाती है।