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सीएफ 640 ट्यूनल सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट 100 टी

आयतन: 100 टी

उपलब्धता स्थिति:
  • G1505-100T
  • Servicebio

उत्पाद वर्णन

उत्पाद की जानकारी:

उत्पाद का नाम

बिल्ली। नहीं।

आयतन

सीएफ 640 ट्यूनल सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

G1505-50T

50t

G1505-100T

100 टी

उत्पाद वर्णन:

एपोप्टोसिस में क्रोमोसोमल डीएनए का टूटना एक क्रमिक प्रक्रिया है। क्रोमोसोमल डीएनए को अंतर्जातीय न्यूक्लियस की क्रिया के तहत 50-300 केबी के बड़े टुकड़ों में गिरा दिया जाता है, और फिर लगभग 30% गुणसूत्र डीएनए सीए 2 + और एमजी 2 +-निर्भरता एंडोन्यूक्लेस की कार्रवाई के तहत है। वे यादृच्छिक रूप से 180-200 बीपी न्यूक्लियोसोमल डीएनए बहुलक बनाने के लिए कटौती कर रहे हैं। इसलिए, एपोप्टोसिस के स्वर्गीय चरण में, डीएनए को 180-200 बीपी टुकड़ों में गिरा दिया जाएगा, और बड़ी संख्या में 3'-ओह सिरों को टूटी हुई जीनोमिक डीएनए पर उजागर किया जाएगा। टर्मिनल Deoxynucleotidyl ट्रांसफरलेस (टीडीटी) एक टेम्पलेट-स्वतंत्र डीएनए बहुलक है जो टूटे डीएनए अणुओं के 3'-ओएच सिरों पर deoxynucleotides के बाध्यकारी को उत्प्रेरित कर सकते हैं। इसलिए, ट्यूनल (टीडीटी मध्यस्थ दत्ती निक एंड लेबलिंग) सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट का उपयोग एपोप्टोसिस के देर से चरण में ऊतक कोशिकाओं के परमाणु डीएनए टूटने का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। सिद्धांत यह है कि टीडीटी एंजाइम की कार्रवाई के तहत, सीएफ 640-डीयूपीपी को 3'-ओह अंत में शामिल किया गया है जब जीनोमिक डीएनए टूटा हुआ होता है, ताकि इसे फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर (सीएफ 640 उत्तेजना 642 एनएम, उत्सर्जन के साथ पता चला जा सके 662 एनएम)। इस किट में विभिन्न प्रकार की अनुप्रयोग हैं और पैराफिन ऊतक अनुभागों, जमे हुए ऊतक खंड, सेल स्लाइड, सेल स्मीयर इत्यादि में सेल एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।

भंडारण और परिवहन

आइस बैग (गीला बर्फ) परिवहन;

यह किट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है। सीएफ 640-डीयूपी लेबलिंग मिश्रण को अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। वैधता अवधि 12 महीने है।

अवयव:

घटक संख्या

अवयव

G1501-50T

G1501-100T

G1505-1

पुनः संयोजित टीडीटी एंजाइम

50 μl

2 × 50 μl

G1505-2

CF640-DUTP लेबलिंग मिक्स

250 μl

2 × 250 μl

G1505-3

समेकन बफर

5 × 1 मिलीलीटर

10 × 1 मिलीलीटर

G1505-4

प्रोटीनेस के (200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर)

1 मिलीलीटर

2 × 1 एमएल

उत्पाद उपयोगकर्ता पुस्तिका

1 पीसी

प्रयोग से पहले तैयारी:

1. पीबीएस फॉस्फेट बफर (जी 0002 या जी 4202 की सिफारिश की जाती है);

2. फिक्सिंग समाधान: पीबीएस या अन्य बफर सिस्टम में भंग 4% पैराफॉर्मल्डेहाइड, पीएच 7.4 (जी 1101 की सिफारिश की जाती है);

3. झिल्ली तोड़ने का समाधान: 0.1% ट्राइटन एक्स -100 0.1% सोडियम साइट्रेट (जी 1204 की सिफारिश की है) में भंग;

4. 0.2% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस तैयार करें; 0.1% ट्राइटन एक्स -100 और 5 मिलीग्राम / एमएल बीएसए युक्त पीबीएस तैयार करें;

5. न्यूक्लियस धुंधला के लिए, आपको अपना खुद का डीएपीआई (2 माइक्रोग्राम / मिली) या पीआई (1 μg / मिली) (जी 1012, जी 1021 की सिफारिश की जाती है) लाने की आवश्यकता है;

6. यदि आपको सकारात्मक नियंत्रण प्रयोग की आवश्यकता है, तो आपको अपना खुद का डीएनएएस I लाने की जरूरत है (जी 3342 की सिफारिश की गई है)

7. यदि प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करना, तो अपने स्वयं के पीआई दाग (जी 1021 अनुशंसित) और आरएनएएस ए (डीएनएएसई फ्री) (जी 3413 अनुशंसित) तैयार करें;

8. ऑपरेशन के दौरान कृपया लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।

ऑपरेशन कदम:

I. नमूना तैयारी

ए पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक खंड

1. 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर xylene में पैराफिन ऊतक खंड को भिगो दें, 2-3 बार दोहराएं; फिर 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल में भिगोएँ, दो बार दोहराएं; अंत में, ढाल इथेनॉल (85%, 75%, डबल स्टीम) पानी का उपयोग करें) प्रत्येक बार एक बार, प्रत्येक बार 5 मिनट के लिए भिगो दें;

2. धीरे-धीरे पीबीएस के साथ अनुभाग को कुल्लाएं और नमूना के चारों ओर अतिरिक्त तरल निकालें; डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और संतुलन अंकन संचालन की सुविधा के लिए ऊतक के बाहरी समोच्च के साथ ऊतक से 2-3 मिमी की दूरी के साथ एक छोटा सर्कल बनाने के लिए एक छोटे सर्कल का उपयोग करें; प्रयोग के दौरान, नमूना को सूखा न दें, और नमूना नमक रखने के लिए संसाधित नमूने को एक आर्द्र बॉक्स में डाल दें;

3. प्रोटीनेस के कार्य समाधान तैयार करें: पीबीएस के साथ प्रोटीनेस के (200 माइक्रोग्राम / मिली) स्टॉक समाधान को 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1: 9 के अनुपात में पतला के रूप में पतला करें;

4. उपर्युक्त प्रोटीनस के कामकाजी समाधान के 100 μl जोड़ें प्रत्येक नमूने के लिए इसे सभी को कवर करने के लिए, और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं;

(नोट: प्रोटीनेस के उपचार ऊतकों और कोशिकाओं के बाद के चरणों में धुंधला अभिकर्मकों के पारगम्यता के लिए मुख्य रूप से सहायक होता है। बहुत लंबा या छोटा ऊष्मायन समय बाद के लेबलिंग दक्षता को प्रभावित करेगा। बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटीनेस के ऊष्मायन समय अनुकूलित किया जा सकता है)

5. पीबीएस समाधान के साथ नमूना घुसपैठ और साफ करें 3 बार, प्रत्येक बार 5 मिनट (प्रोटीनेस के को साफ धोया जाना चाहिए, अन्यथा यह बाद के लेबलिंग प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करेगा, और नमूना रखने के लिए संसाधित नमूना को आर्द्र बॉक्स में रखें नम;

6. (वैकल्पिक चरण) नमूना पर अतिरिक्त तरल निकालें, ऊतक को 0.1% सोडियम साइट्रेट में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) की उचित मात्रा में जोड़ें, पूरी तरह से ऊतक घुसपैठ करें, और कमरे के तापमान पर इसका इलाज करें 20 मिनट; टूटने के उपचार के पूरा होने के बाद, नमूना प्रत्येक बार 5 मिनट के लिए 3 बार पीबीएस समाधान के साथ धोया जाता है; नमूना नमक रखने के लिए इलाज नमूना एक आर्द्र बॉक्स में रखा जाता है।

बी ऊतक जमे हुए अनुभाग

1. निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मल्डेहाइड समाधान (पीबीएस में भंग) में स्लाइड्स को विसर्जित करें, और कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए सेते हैं;

2. फिक्सेटिव से फिल्म निकालने के बाद, इसे धुएं हुड में स्वाभाविक रूप से सूखने दें;

3. स्लाइड पर शेष फिक्सेटिव समाधान को हटाने के लिए शुद्ध पानी या पीबीएस में स्लाइड्स को कुल्लाएं;

4. डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और संतुलन अंकन संचालन को सुविधाजनक बनाने के लिए ऊतक के परिधि के साथ ऊतक से अलग एक छोटा सर्कल 2-3 मिमी खींचने के लिए एक हिस्टोकेमिकल पेन का उपयोग करें; प्रयोग के दौरान, नमूना सूखा न दें, और संसाधित नमूना नमूना नमक को एक आर्द्र बॉक्स में रखें;

5. प्रोटीनेस के कार्य समाधान तैयार करें: 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1: 9 के अनुपात में पतला के रूप में पीबीएस के साथ प्रोटीनेस के (200 माइक्रोग्राम / मिली) स्टॉक समाधान को पतला करें;

6. प्रत्येक नमूने में उपर्युक्त प्रोटीनस के काम कर रहे समाधान के 100 μl जोड़ें ताकि यह पूरी तरह से कवर हो, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं;

(नोट: प्रोटीनेस के उपचार मुख्य रूप से ऊतकों और कोशिकाओं को बाद के चरणों में धुंधला अभिकर्मकों को पार करने में मदद करता है। यदि ऊष्मायन समय बहुत लंबा या बहुत छोटा है, तो यह बाद की लेबलिंग दक्षता को प्रभावित करेगा। यदि कोई बेहतर परिणाम प्राप्त नहीं होता है, तो ऊष्मायन प्रोटीनेस के समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है)

7. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए पीबीएस समाधान के साथ नमूना 2-3 बार कुल्लाएं (प्रोटीनेस के को साफ धोया जाना चाहिए, अन्यथा यह बाद के लेबलिंग प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करेगा, और नमूना नमक को रखने के लिए संसाधित नमूने को एक आर्द्र बॉक्स में रखें ;

8. (वैकल्पिक चरण) ऊतक को उचित मात्रा में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 0.1% सोडियम साइट्रेट में भंग) जोड़ें, ऊतक को पूरी तरह से घुसपैठ करें, और इसे कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक इलाज करें। टूटने के उपचार पूरा होने के बाद भी यही सच है। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए पीबीएस समाधान के साथ नमूना कुल्लाएं, और नमूना नमक को रखने के लिए संसाधित नमूने को एक आर्द्र बॉक्स में रखें।

डी सेल स्मीयर

1. लगभग 2 × 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर पीबीएस में कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें, एंटी-ड्रॉप ग्लास स्लाइड पर सेल निलंबन के 50-100 μl पिपेट, और सेल निलंबन को धीरे-धीरे फैलाने के लिए एक साफ ग्लास स्लाइड का उपयोग करें;

2. पीबीएस में 4% ताजा तैयार पैराफॉर्मल्डेहाइड युक्त एक धुंध वाले जार में स्लाइड को विसर्जित करें, कोशिकाओं को ठीक करें, और उन्हें 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें;

3. पीबीएस में स्लाइड को विसर्जित करें, इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें, और फिर एक बार दोहराएं;

4. धीरे-धीरे अतिरिक्त तरल को हटा दें, और फ़िल्टर पेपर के साथ स्लाइड पर नमूना के चारों ओर अतिरिक्त तरल को ध्यान से ब्लॉट करें। डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और बैलेंस मार्किंग ऑपरेशंस को सुविधाजनक बनाने के लिए सेल की परिधि के साथ एक छोटा सर्कल खींचने के लिए एक हिस्टोकेमिकल पेन का उपयोग करें। प्रयोग के दौरान, नमूना सूखा मत देना;

5. प्रत्येक नमूना पीबीएस में तैयार 0.2% ट्राइटन एक्स -100 समाधान में विसर्जित होता है, और पारगम्यता के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं;

6. पीबीएस समाधान से भरे खुले बीकर में नमूना 2-3 बार विसर्जित और साफ करें;

6. धीरे-धीरे अतिरिक्त तरल को हटा दें, और स्लाइड पर नमूने के चारों ओर तरल को ध्यान से अवशोषित करने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करें। नमूना नमक रखने के लिए संसाधित नमूना एक आर्द्र बॉक्स में रखा जाता है।

द्वितीय। DNASE I उपचार सकारात्मक नियंत्रण प्रयोग (वैकल्पिक चरण)

नमूना को पारगम्य करने के बाद, सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए डीएनएएसई I (G3342 अनुशंसित) के साथ नमूना का इलाज करें।

1. 100 μl 1 × DNASE I बफर जोड़ें (तैयारी विधि: 10 μl 10 × DNASE I बफर लें, फिर मिश्रण करने के लिए 90 μl deionized पानी जोड़ें) पारगम्य नमूना पर छोड़ दें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं;

2. धीरे-धीरे अतिरिक्त तरल को हटा दें और डीएनएएसई I (20 यू / एमएल) युक्त कार्य समाधान के 100 μl जोड़ें (तैयारी विधि: 10 μl 10 × DNASE I बफर लें, फिर 2 μl Dnase I जोड़ें, और फिर 88 μl deionized पानी मिश्रण जोड़ें ), कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं;

3. धीरे-धीरे अतिरिक्त तरल को हटा दें, और पीबीएस से भरे धुंधला जार में स्लाइड्स को 3-4 बार धोएं।

(नोट: सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड के लिए एक अलग धुंधला टैंक का उपयोग किया जाना चाहिए, अन्यथा सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड पर अवशिष्ट डीएनएएसई I प्रायोगिक स्लाइड पर उच्च पृष्ठभूमि पेश कर सकता है)

तृतीय। अंकन और परीक्षण

1. समेकन: नमूना क्षेत्र का परीक्षण करने के लिए प्रत्येक नमूने में 50 μl समेकन बफर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं;

2. लेबलिंग समाधान तैयारी: बर्फ पर थॉ सीएफ 640-डीयूपी लेबलिंग मिश्रण और समेकन बफर, और पुनः संयोजक टीडीटी एंजाइम के अनुपात का पालन करें: सीएफ 640-डीयूटीपी लेबलिंग मिक्स: समेकन बफर = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5: 50 ) सभी प्रयोगों के लिए पर्याप्त टीडीटी ऊष्मायन बफर मिलाएं। विशिष्ट प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की मात्रा को स्लाइड के आकार के अनुसार उचित अनुपात में समायोजित किया जा सकता है;

3. नकारात्मक नियंत्रण प्रणाली: पुनः संयोजक टीडीटी एंजाइम के बिना एक नियंत्रण टीडीटी ऊष्मायन बफर तैयार करें और इसे डीडीएच 2 ओ के साथ बदलें;

4. लेबलिंग: संतुलित संतुलन बफर को हटाने का प्रयास करें, और फिर प्रत्येक ऊतक नमूने में 56 μl टीडीटी ऊष्मायन बफर जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सेते हैं; स्लाइड सूखने के लिए सावधान रहें, और स्लाइड को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए;

5. तुरंत 4 गुना के लिए पीबीएस के साथ ऊतक नमूने कुल्ला, प्रत्येक बार 5 मिनट;

6. फिल्टर पेपर के साथ नमूना के चारों ओर पीबीएस समाधान को धीरे-धीरे मिटा दें;

7. परमाणु धुंधला: नमूना धुंधला टैंक में दाग है, और स्लाइड अंधेरे में डैपी समाधान (ताजा तैयार और पीबीएस के साथ पतला) युक्त धुंधला टैंक में विसर्जित होती है, और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए छोड़ दी जाती है;

8. बढ़ते: नमूना दाग के बाद, प्रत्येक बार 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ ऊतक नमूना 3 बार धो लें। फिर धीरे-धीरे अतिरिक्त तरल को हटा दें, माउंट करने के लिए ड्रॉपवाइज एंटी-फ्लोरोसेंस क्वेंचिंग माउंटिंग टैबलेट (अनुशंसित G1401) जोड़ें;

9. माइक्रोस्कोपिक परीक्षा: फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे तुरंत नमूना का विश्लेषण करें, और स्लाइड को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। डीएपीआई नीले रंग में एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कोशिकाओं को दाग सकता है, और केवल एपोप्टोटिक न्यूक्लियस में सीएफ 640-डीयूटीपी के निगमन द्वारा स्थानीयकृत गुलाबी फ्लोरोसेंस हो सकता है।

Iv। निलंबन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें

1. पीबीएस के साथ दो बार परीक्षण किए जाने वाले कोशिकाओं को धोएं, 4 डिग्री सेल्सियस (500 ग्राम) पर अपकेंद्रित्र और 500 μl पीबीएस में resuspend;

2. निर्धारण: नमूना के लिए पीबीएस के साथ तैयार 1% पैराफॉर्मल्डेहाइड समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें, कोशिकाओं को ठीक करें, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें;

3. कोशिकाओं को 300 ग्राम पर 300 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें, सतह पर तैरनेवाला हटा दें और उन्हें 5 मिलीलीटर पीबीएस में दो बार दोबारा दबाएं, और अंत में 500 μl पीबीएस में कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें;

4. पारगम्यता: नमूना में बर्फ पर 70% इथेनॉल प्री-कूल्ड के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं;

(नोट: कक्षों को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस समाधान में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ भी पारगम्य किया जा सकता है)

5. 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, कोशिकाओं को 5 मिलीलीटर पीबीएस में resuspended किया गया था, और सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद 1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspended;

6. समेकन: लगभग 2 × 106 कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोक्रिंटिफ्यूज ट्यूब, 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटा दें, और 80 μl संतुलन बफर में resuspend, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं;

7. लेबलिंग समाधान की तैयारी: बर्फ पर थॉ सीएफ 640-डीयूपी लेबलिंग मिश्रण और समेकन बफर, और पुनः संयोजक टीडीटी एंजाइम के अनुपात का पालन करें: सीएफ 640-डीयूटीपी लेबलिंग मिश्रण: समेकन बफर = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5: 50) सभी प्रयोगों और वैकल्पिक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त टीडीटी ऊष्मायन बफर मिलाएं;

8. लेबलिंग: कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर केन्द्रित किया गया था, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और गोली को 56 μl टीडीटी ऊष्मायन बफर में पुन: प्रस्तुत किया गया था, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ऊष्मायन किया गया था, जो प्रकाश से संरक्षित था। धीरे-धीरे प्रत्येक 15 मिनट में माइक्रोप्रिपेट के साथ कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करें;

9. प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 20 मिमी ईडीटीए का 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे माइक्रोप्रिपेट के साथ मिश्रण करें;

10. 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटा दें और पीबीएस के साथ तैयार 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान के 1 मिलीलीटर में गोली को पुन: प्रस्तुत करें, जिसमें 5 मिलीग्राम / एमएल बीएसए शामिल है, और दो बार धोएं;

11. परमाणु धुंधला: 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटा दें और 0.5 मिलीलीटर डीएपीआई समाधान में सेल गोली को पुन: पेश करें जिसमें 250 माइक्रोग्राम डीएनएएसई-फ्री आरएनएएस ए शामिल है। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं;

12. ऑन-बोर्ड डिटेक्शन: कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, डीएपीआई नीले रंग में एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कोशिकाओं दोनों को दाग सकता है, और केवल एपोप्टोटिक न्यूक्लियस में गुलाबी फ्लोरोसेंस होता है जहां सीएफ 640-डीयूटीपी शामिल और स्थानीयकृत होता है।

वी। प्रायोगिक प्रक्रिया आरेख

G1505-100TDG1505-100TCG1505-100TB

ध्यान:

यह उत्पाद केवल नैदानिक ​​निदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए है!

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