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Tsaplus फ्लोरोसेंस ट्रिपल धुंधला किट Tyramide सिग्नल प्रवर्धन immunofluorescence अभिकर्मक

विशिष्टता: 50 टी
उपलब्धता स्थिति:
  • जी 1236-50 टी
  • Servicebio

उत्पाद वर्णन

Tsaplus फ्लोरोसेंस ट्रिपल धुंधला किट

बिल्ली सं। G1236-50T

पैकेज सामग्री:

उत्पाद वस्तु संख्या

उत्पाद का नाम

विनिर्देश

Tsaplus फ्लोरोसेंस ट्रिपल धुंधला किट

जी 1236-50 टी

50t

G1236-100T

100 टी

उत्पाद का परिचय:

यह उत्पाद Tsaplus फ्लोरोसेंट ट्रिपल धुंधला किट पैराफिन खंडों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस कई धुंध के लिए उपयुक्त है, खासतौर पर एक ही स्रोत से प्राथमिक एंटीबॉडी के प्राथमिक एंटीबॉडी के कई फ्लोरोसेंट इम्यूनोलबेलिंग के लिए, और विभिन्न स्रोतों से एंटीबॉडी के कई फ्लोरोसेंट इम्यूनोलबेलिंग के लिए भी उपयुक्त है। मुख्य सिद्धांत Tyramide सिग्नल एम्पलीफिकेशन (टीएसए, टायरामाइड सिग्नल एम्पलीफिकेशन) पर आधारित है, इसके बाद इसे टीएसए तकनीक के रूप में जाना जाता है। टीएसए तकनीक का मुख्य सिद्धांत टायरामाइड की पेरोक्साइड प्रतिक्रिया का उपयोग करना है (यानी, फ्लोरोसेंटली लेबल वाला टायरामाइड नमक एच 2 ओ 2 द्वारा उत्प्रेरित एचआरपी के तहत एक सहसंयोजक बॉन्ड बाध्यकारी साइट) को बड़ी संख्या में एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए है। यह उत्पाद आस-पास के प्रोटीन अवशेषों (ट्राइपोफान, हिस्टिडाइन, और टायरोसिन अवशेषों सहित) के साथ इंटरैक्ट कर सकता है) सिग्नल प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग साइट पर फ्लोरोसिसिन बयान की एक बड़ी मात्रा बनाने के लिए गठबंधन कर सकता है। यह किट टायरामाइन लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट रंग 488/555/647 का उपयोग करता है। परिणामी फ्लोरोसेंट टायरामाइन में मजबूत फ्लोरोसेंस और स्थिर सिग्नल होता है, जिसका उपयोग कई फ्लोरोसेंट धुंधला होने के लिए कई बार-बार इम्यूनोलबेलिंग के लिए किया जा सकता है।

टीएसए श्रृंखला फ्लोरोसेंट धुंधला किट की प्रासंगिक फ्लोरोसेंट रंगों के फ्लोरोसेंस स्पेक्ट्रम डेटा निम्नानुसार हैं:

फ्लोरोसेंट डाई प्रकार

पूर्व / ईएम

FITC-TYRAMIDE

492/518

Cy3-Tyramide

555/569

IF488-Tyramide

491/516

IF555-Tyramide

557/570

IF647-Tyramide

656/670

जमा करने की स्थिति:

आइस पैक परिवहन, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, वैध अवधि 12 महीने है।

संयोजन

घटक संख्या

अवयव

जी 1236-50 टी

G1236-100T

भंडारण

G1236-1

IF488-Tyramide

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-2

IF555-Tyramide

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-3

IF647-Tyramide

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-4

Tyramide diluent

50 मिलीलीटर

50 मिलीलीटर

4 ℃

G1236-5

DAPI (उपयोग करने के लिए तैयार)

10 मिलीलीटर

20 मिलीलीटर

4 ℃

G1236-6

ऊतक autofluorescence quencher एक समाधान

10 मिलीलीटर

20 मिलीलीटर

कमरे का तापमान

G1236-7

ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर बी समाधान

10 मिलीलीटर

20 मिलीलीटर

कमरे का तापमान

G1236-8

विरोधी प्रतिदीप्ति क्वेंचर

5 मिलीलीटर

10 मिलीलीटर

-20 ℃

प्रयोग से पहले तैयारी:

1. 0.01 एमओएल / एल पीबीएस बफर (पीएच 7.0-7.4, अनुशंसित जी 4202 या जी 0002), 3% H2O2 और 0.3% H2O2 तैयार करें;

2. प्राथमिक एंटीबॉडी और संबंधित एचआरपी-लेबल वाली माध्यमिक एंटीबॉडी, एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान तैयार करें (एंटीबॉडी और ऊतक के प्रकार के अनुसार उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान चुनें);

3. खुराक के अनुसार, निम्नलिखित अनुपात के अनुसार टीएसए रंगाई कार्य समाधान तैयार करें।

टीएसए धुंधला काम समाधान

अभिकर्मक वस्तु

आयतन

टीएसए -488 धुंधला समाधान

Tyramide diluent

1 मिलीलीटर

0.3% H2O2

10 μl

IF488-Tyramide

2 μl

टीएसए -555 धुंधला समाधान

Tyramide diluent

1 मिलीलीटर

0.3% H2O2

10 μl

IF555-Tyramide

2 μl

टीएसए -647 धुंधला समाधान

Tyramide diluent

1 मिलीलीटर

0.3% H2O2

10 μl

IF647-Tyramide

2 μl

नोट: फ्लोरोसेंट टायरामाइड पिघलने के बाद, इसे थोड़े समय के लिए अपकेंद्रित्र, और फिर इसे स्वच्छ विंदुक युक्तियों के साथ मिश्रण के बाद ले जाएं। टीएसए धुंधला काम समाधान के लिए तत्काल उपयोग के लिए तैयार होने की सिफारिश की जाती है। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए, और यह 24 घंटे के भीतर प्रभावी है।

कदम

ऊतक स्लाइड्स को एक उदाहरण के रूप में लेना, निम्नलिखित प्रयोगात्मक चरणों में पानी शुद्ध पानी है।

1. पानी के लिए ऊतक खंड deparaffinize;

2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति: प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुसार और नमूना के प्रकार के अनुसार, ऊतक खंड पर एंटीजन पुनर्प्राप्ति करने के लिए एक उपयुक्त विधि का उपयोग करें।

3. पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, हर बार 5 मिनट, ऊतक को सर्कल करने और चिह्नित करने के लिए एक पाप कलम का उपयोग करें;

4. 100 μL ऊतक Autofluorescence क्वेंचर एक ऊतक को एक समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, और 5 मिनट के लिए धो लें;

5. निष्क्रियता अंतर्जात पेरोक्साइडस: ऊतक को ढंकने के लिए सेक्शन में 3% एच 2 ओ 2 जोड़ें, और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंध को कम करने के लिए एंडोजेनस पेरोक्साइडस को अवरुद्ध करने के लिए 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं। 1 × पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

6. ब्लॉक: स्लाइड के बाद थोड़ा सूखने के बाद, 3% बीएसए या सीरम को 30 मिनट के लिए सील करने के लिए ड्रॉपवाइड जोड़ा जाता है। अवरुद्ध अभिकर्मक प्राथमिक एंटीबॉडी और द्वितीयक एंटीबॉडी की प्रजातियों के अनुसार निर्धारित किया जाता है;

7. प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं: प्राथमिक एंटीबॉडी को 1 × पीबीएस या अवरुद्ध समाधान (जी 2010 की सिफारिश की गई) के साथ उचित एकाग्रता में पतला करें। धीरे-धीरे खंड पर अवरुद्ध समाधान को हिलाएं, ऊतक को ढंकने के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और सेक्शन फ्लैट को पानी के साथ एक आर्द्र कक्ष बॉक्स में रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 1 × पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

8. एचआरपी-लेबलेड माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं: द्वितीयक एंटीबॉडी को 1 × पीबीएस या अवरुद्ध समाधान (जी 2010 की सिफारिश की गई) के साथ उचित एकाग्रता में पतला करें, ऊतक को द्वितीयक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 50 मिनट के लिए सेते हैं। 1 × पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

9. ऊतक को 50-100μl टीएसए -488 धुंधला काम समाधान जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक पूरी तरह से कवर किया गया हो, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 1 × पीबीएस 3 बार, प्रत्येक बार 5 मिनट के साथ धोएं;

10. माइक्रोवेव उपचार: ऊतक अनुभाग को एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान से भरा एक मरम्मत बॉक्स में रखा जाता है (बाध्य प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए माइक्रोवेव हीटिंग उपचार के लिए उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान का चयन करें)। इस चरण में, अत्यधिक तरल वाष्पीकरण के कारण सूखे फ्लेक्स को रोकने के लिए आवश्यक है।

11. दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हुए चरण 7 को दोहराएं: एक उचित एकाग्रता के लिए पीबीएस (या अन्य एंटीबॉडी) के साथ परीक्षण करने के लिए दूसरी एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) को पतला करें। धीरे-धीरे खंड पर तरल को हिलाएं, ऊतक को ढंकने के लिए पतला एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और सेक्शन फ्लैट को एक आर्द्रता वाले बॉक्स में पानी के साथ रखें और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

12. संबंधित एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हुए चरण 8 को दोहराएं: माध्यमिक एंटीबॉडी को पीबीएस (या अन्य एंटीबॉडी diluent) के साथ उचित एकाग्रता में पतला करें, ऊतक को द्वितीयक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 50 मिनट के लिए सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

13. ऊतक के लिए 50-100μl टीएसए -555 धुंधला काम समाधान जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक पूरी तरह से कवर हो, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

14. माइक्रोवेव उपचार: ऊतक अनुभाग को एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान से भरा एक मरम्मत बॉक्स में रखा गया है (बाध्य प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए माइक्रोवेव हीटिंग उपचार के लिए उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान का चयन करें)। इस चरण में, अत्यधिक तरल वाष्पीकरण के कारण सूखे फ्लेक्स को रोकने के लिए आवश्यक है।

15. दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हुए चरण 7 को दोहराएं: एक उचित एकाग्रता के लिए पीबीएस (या अन्य एंटीबॉडी diluent) के साथ परीक्षण करने के लिए दूसरी एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) को पतला करें। धीरे-धीरे खंड पर तरल को हिलाएं, ऊतक को ढंकने के लिए पतला एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और सेक्शन फ्लैट को एक आर्द्रता वाले बॉक्स में पानी के साथ रखें और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

16. संबंधित एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हुए चरण 8 को दोहराएं: द्वितीयक एंटीबॉडी को पीबीएस (या अन्य एंटीबॉडी पतला) के साथ उचित एकाग्रता में पतला करें, ऊतक को द्वितीयक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 50 मिनट के लिए सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

17. ऊतक को 50-100μl टीएसए -647 धुंधला काम समाधान जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक पूरी तरह से कवर हो, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक बार 5 मिनट;

18. डीएपीआई के साथ न्यूक्लियस काउंटरस्टिंग: अनुभागों को थोड़ा सूखने के बाद, ऊतक के लिए डीएपीआई धुंधला समाधान जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। प्रत्येक बार पीबीएस 3 बार, 5 मिनट के साथ धो लें।

19. ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचिंग: ऊतक को ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर बी समाधान को ऊतक में जोड़ें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, और 3 मिनट के लिए चलने वाले पानी के साथ कुल्ला;

20.Mounting और माइक्रोस्कोपिक परीक्षा: अनुभागों को थोड़ा सूखने के बाद, स्लाइड्स को माउंट करने के लिए एंटी-फ्लोरोसेंस क्वेंचर जोड़ें। एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप या एक confocal लेजर माइक्रोस्कोप के साथ छवियों का निरीक्षण और एकत्रित करें। स्लाइस को प्रकाश-सबूत स्लाइड बॉक्स में 15 डिग्री सेल्सियस पर 15 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

एहतियात

1. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी की तुलना में, टीएसए किट में उच्च संवेदनशीलता और मजबूत संकेत है। इसलिए, प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता को गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के कारण होने वाली पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंस को कम करने के लिए एंटीबॉडी मैनुअल में अनुशंसित कमजोर अनुपात के आधार पर आमतौर पर 5-10 गुना कम हो जाना चाहिए। सर्वोत्तम प्रभाव प्राप्त करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की ढाल एकाग्रता निर्धारित करने की अनुशंसा की जाती है।

2. यदि पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंस मजबूत है, तो ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचिंग चरण जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

3. फ्लोरोसेंट टायरामाइड का अनुशंसित कमजोर अनुपात 1: 500 है, और प्रयोगात्मक परिणामों के अनुसार कमजोर अनुपात को समायोजित किया जा सकता है (अनुशंसित कमजोर अनुपात सीमा 1: 200-1: 1000 है)।

4. एकाधिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी को पहले से जोड़ने की सिफारिश की जाती है, फिर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सेते हैं; पहले कम-बहुतायत लक्ष्य प्रोटीन के अनुरूप एंटीबॉडी सेते हैं, और फिर उच्च बहुतायत लक्ष्य प्रोटीन के अनुरूप एंटीबॉडी सेते हैं।

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